Оборудование и химическая посуда

•  Холодильник для хранения зафиксированного материала

•  Микроскоп с фотонасадкой

•  Мерная посуда для приготовления растворов

•  Обезжиренные предметные и покровные стекла

•  Скальпель

•  Пинцеты

•  Препаровальные игл

•  Пробирки

Реактивы

•  Фиксатор Карнуа - абсолютный спирт, хлороформ и ледяная уксусная кислота в соотношении 6:3:1, или фиксатор Кларка - абсолютный спирт и ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1.

•  Краситель - 2 г орсеина заливают 45 мл ледяной уксусной кислотой и нагревают до появления первых пузырьков, затем добавляют 55 мл дистиллированной воды. После охлаждения добавляют 1Н HCI (на 9 частей краски 1 часть соляной кислоты). Перед употреблением краску фильтруют.

•  Спирт 96⁰ , 70⁰ .

•  45% уксусная кислота.

Ход работы

Эмбрионов рыб на ранних стадиях развития фиксируют в фиксаторе Карнуа. Через один час фиксатор следует сменить, а через сутки промыть материал 96⁰ спиртом и перенести в 70⁰ спирт, хранить в холодильнике до последующего приготовления давленых временных ацетоорсеиновых препаратов хромосом.

Для приготовления препаратов используется введенный Свердсоном метод раздавливания эмбрионов рыб. После тщательной очистки от желтка зародыши окрашивают в течение суток ацетоорсеином. Окрашенный материал промывают в 45% уксусной кислоте и переносят на предметное стекло в каплю 45% уксусной кислоты, покрывают покровным стеклом и легким нажатием на него в строго вертикальном направлении раздавливают (до состояния окрашенного облачка). Сила нажима вырабатывается практически, для чего необходимо следить за степенью расположения клеток в один слой при помощи микроскопа. Анализ препаратов проводят под микроскопом с использованием иммерсионного объектива.

Критерии оценки препарата

При работе по анализу структурных мутаций хромосом клетки используют только препараты, отвечающие следующим требованиям: анализируются однослойные целые клетки с неразорванной оболочкой; хромосомы внутри клетки должны быть хорошо окрашенными, лежащими на фоне прозрачной цитоплазмы. При анализе учитываются анафазы и телофазы, в которых расстояние между группами хромосом больше ширины одной группы. Не рекомендуется исследовать телофазы, в которых начал образовываться фрагмопласт.

Оценка результатов

При регистрации хромосомных повреждений учитывают одиночные и групповые хромосомные и хроматидные мосты, парные и одиночные фрагменты, отставание хромосом, многополюсные митозы.

Аберрантные митозы подсчитывают как одиночные, независимо от того, приходилось ли на митоз множество аберраций или одна.

Подсчитывают количество нормальных и аберрантных анафаз-телофаз и рассчитывают процент аберрантных клеток по формуле:

A/B*100%

где А - количество клеток с нарушениями;

В - общее количество клеток.