Оборудование :

Термостаты 37 и 56 градусов,

печь для расплавления препаратов,

холодильники,

микротомы,

микроскопы,

электроплитки,

термостолики,

11-клавишные счетчики, посуда.

Фиксация . После взятия материала для микроскопического исследования его помещают в фиксирующую жидкость. Цель фиксации состоит в задержке изменений, возникающих в тканях, изолированных от живого организма и сохранении тканевых и клеточных структур в состоянии их прижизненного строения.

С целью равномерного омывания кусочков тканей фиксатором, емкости встряхивают с периодом в несколько (1-2) часов. Для равномерного пропитывания материала фиксатором кусочки органов берутся размером 0,5 - 1 см.

В качестве фиксатора используется 10% раствор формалина, приготовленный на физиологическом растворе, так как дистиллированная вода вызывает значительное обводнение и набухание тканей. Для гистологических и гистохимических исследований в качестве фиксатора используется жидкость Буэна. В фиксаторе может сохраняться - от 48 часов до 30 дней.

Промывка и обезвоживание материала.

Промывкой обеспечивается первоначальное очищение материала от самого фиксатора и различных осадков, возникающих в период фиксации. Производится промывка в проточной водопроводной воде в течение 10 - 20 минут.

Для обезвоживания используется набор спиртов (этиловый спирт) повышающейся концентрации от 70 до 100 %.

Для получения хороших микроскопических препаратов большое значение имеет постепенность обезвоживания, так как при быстром обезвоживании ткани (особенно те, которые имеют рыхлую консистенцию) могут сморщиваться и деформироваться ( Елисеев, 1954; 1959) .

Используется следующая методика обезвоживания спиртами:

70% - 2 час., 80% - 12 час., 90% - 2 час., 96% - 1 час., 100% - 1 час.

Периодически наборы спиртов обновляются, так как в процессе работы происходит их обводнение и загрязнение веществами, извлекаемыми из материала, особенно жиром.

Заливка материала в застывающие среды.

После обезвоживания фрагменты органов тщательно промакают фильтровальной бумагой и помещают в 1% раствор целлоидина.

Раствор приготавливается путем растворения 1 г. целлоидина в 100 мл смеси равных частей спирта и эфира. В этой концентрации целлоидин легко проникает в глубь объекта и полностью пропитывает его. В среднем, длительность содержания материала в растворе целлоидина составляет 6 суток.

На следующем этапе производится очистка материала от целлоидина. Для этого образцы органов и тканей отмывают два часа в хлороформе, затем 2 часа в термостате при температуре 37 градусов в снегоподобной массе, представляющей насыщенный раствор парафина в хлороформе. Далее проводится в термостате при температуре 56 градусов пропитывание в чистом парафине в течение 1 час., затем пробы переносятся в чистый парафин - на 1 час. После этого кусочки заливаются в смесь 100 г. парафина с 5 г. воска и быстро охлаждаются в воде с кубиками льда для предотвращения образования воздушных пузырьков в парафиновых блоках.

Полученные парафиновые блоки наплавляются на деревянные кубики, необходимые для закрепления блоков при резке тканей на микротоме.

Для заливки материала используется белый парафин, имеющий точку плавления не выше 52- 54 °С. Для большей пластичности парафина к нему прибавляется 5% пчелиного воска. С целью вытеснения из расплавленного парафина излишков газов, его несколько раз кипятят на электрической плитке с закрытой спиралью с последующим быстрым охлаждением на ледяной бане.

Подготовка срезов.

Приготовление срезов производится на санном микротоме с использованием микротомных ножей. Толщина получаемых срезов - 1, 2, 3. 4, 5, 6 мкм.

Для удаления складок и расправки ленты или серии срезов их помещают на поверхность в широком сосуде (кристаллизатор) с водой при температуре 40 °С. Расправка срезов производится препаровальной иглой. Затем расправленные срезы помещаются на специально приготовленное предметное стекло и высушиваются на специальном столике с подогревом до 370 градусов. Стекла обезжириваются в смеси спирт-эфир (1:1).

Для более прочного приклеивания парафиновых срезов предметные стекла предварительно тщательно смазываются смесью белка с глицерином в соотношении 1:1. Нанесенный на предметное стекло тонкий слой смеси нагревают над пламенем спиртовки для удаления влаги. В дальнейшем эти стекла используют для наклеивания срезов препарата. Стекла подписывают тушью, смешанной с белком (1:1) и прокаливают.

Окраска срезов .

Перед окраской срезы, хорошо высушенные и приклеенные к предметным стеклам, освобождают от парафина. Для этого срезы помещают на 30 сек. в ксилол I , затем на 30 сек. в ксилол II . После растворения парафина препараты выдерживают 1 мин. в 100% спирте, затем 1 мин. в 70% спирте. После спиртов препараты промываются дистиллированной водой.

Окрашивание срезов производится по методу Маллори (Роскин,1951).

Срезы из дистиллированной воды переносятся в 0,1% раствор кислого фуксина на 3 мин. При этом срезы приобретают розовую окраску. Следующий этап - 5 мин. в 1% растворе фосфорномолибденовой кислоты. Этот раствор закрепляет окраску кислым фуксином. Срезы ополаскивают в дистиллированной воде, затем на 1 мин. погружают в смесь анилинового синего, оранжевого G и щавелевой кислоты.(Смесь Маллори) (Роскин, 1951).

Послее окрашивания срезы дифференцируются 70% спиртом (2-3 сек.) и 96% спиртом (2-3 мин.), проводятся через ксилол и заключаются в канадский бальзам. Готовые препараты, которые могут храниться бессрочно, изучаются под микроскопом при увеличении объективов 8 x , 40 x , 90 x (иммерсия).

Микроскопирование.

Фиксированные препараты срезов тканей микроскопируются на приборах "Olympus" (Япония) и "Jenamed" (Германия).

Выбор увеличения при рассмотрении объектов зависит от конкретных задач - от 40 х до 1000 х .

При микроскопировании обращается внимание на признаки наличия /отсутствия морфологических изменений в клетках и тканях, имеющих прогностическое значение для определения функционального состояния органа. Микроскопированием определяется:

•  для гонад - диаметр зрелых и незрелых ооцитов, диаметр ядра ооцитов, расстояние от оболочки ооцита до ядра как показатель стадии зрелости ооцита ( Сакун, Буцкая , 1963), деформированность ооцитов, состояние цитоплазмы, стадия зрелости мужских половых продуктов ( Турдаков А.Ф., 1972 ), состояние стенок ампул и кровеносных сосудов;

•  для печени - структура паренхимы и соединительной ткани, диаметр ядер гепатоцитов, состояние кровеносных сосудов, состояние цитоплазмы гепатоцитов;

•  для селезенки - то же самое, что и для печени, а также размеры красно-белой пульпы, наличие клеток крови, скопление пигментов;

•  для почек - состояние эпителия извитых канальцев, состояние гемопоэтической, соединительной тканей, Боуменовых капсул, скопление пигментов.

Цитометрические исследования проводятся с помощью окуляр-микрометра с ценой деления, определенной для каждого микроскопа индивидуально