Взятие крови.

При проведении гематологических анализов кровь берется у рыбы сразу же после отлова, иначе изменится общая картина показателей.

Кровь берут из хвостовой вены или луковицы аорты, из сосудов жабр. Существует определенная последовательность взятия крови на разные виды анализа. В первую очередь берут кровь в пипетку Сали для определения содержания гемоглобина, затем в - смесители для подсчета эритроцитов и лейкоцитов, далее - в препарат Панченкова для определения скорости оседания эритроцитов, в капилляр гематокрита, последним делается мазок.

Взятие крови при работе с ценными (осетровые) или редкими рыбами производят прижизненным способом. В такой ситуации используется пипетка Пастера, которой кровь из гемального канала хвостового стебля набирают однократно, сразу для всех манипуляций. Это артериальная кровь с некоторой примесью венозной.

Для полного клинического анализа используют особей не меньше 1,5 - 2 г, у рыб с меньшей массой можно сделать только мазок для определения лейкоцитарной формулы и морфологической характеристики эритроцитов. Причем для получения достоверных результатов следует сделать не менее 10 параллельных определений в каждой из исследуемых групп.

Определение форменных элементов крови в окрашенном мазке .

Для изучения структуры клеток, подсчета незрелых эритроцитов (с целью оценки интенсивности эритропоэза) и определения лейкоцитарной формулы делается мазок крови.

Техника приготовления мазка.

На чисто вымытое и обезжиренное предметное стекло наносят каплю крови, отступив 1,5-2 см от его края, с помощью специального шлифованного стекла, поставив его под углом 45 о , легким и быстрым движением растягивают каплю по предметному стеклу до полного ее исчерпывания.

Правильно сделанный мазок тонкий, прозрачный, желтоватого цвета. Мазок сушат на воздухе. Высушенному мазку присваивают номер, указывают дату. Данные проставляют на предметном стекле. Запись в соответствии с номером делают в полевом дневнике.

Фиксация мазка .

Сухой мазок обрабатывают фиксирующими жидкостями, придающими форменным элементам стойкость к содержащейся в красителях воде. Для фиксации пользуются метиловым спиртом, 96 о этиловым спиртом или смесью его с равным количеством эфира (мазок погружается в фиксатор на 20-30 минут).

Фиксирующая жидкость служит неограниченное время. После фиксации мазок ставят в вертикальное положение на фильтровальную бумагу в специальный контейнер для просушивания, затем красят.

Окраска мазка.

Окрашивание производят по методу Романовского стандартным раствором Гимза, который заключается в избирательном поглощении трех красящих веществ: азура, метиленовой сини и эозина. Азур имеет амфотерноосновную реакцию, эозин - кислую, а метиленовая синь - щелочную (Глаголева, 1981).

Краска Гимза состоит из 3 г азура II (смесь равных частей азура I т метиленового синего), 0,8 г эозина водорастворимого желтого, 250 мл метилового спирта, 250 мл глицерина.

Окраску проводят над чашкой Петри. Мазки располагают на двух параллельных стеклянных палочках, соединенных на концах резиновыми трубками, и положенных на края емкости.

Краску наливают пипеткой толстым слоем на мазок и оставляют на 20-30 минут. Затем ее сливают и препарат промывают 10 мин. под струей водопроводной воды, после чего стекла ставят на фильтровальную бумагу вертикально. Для хранения готовые мазки помещают в специальный контейнер (мазок к мазку) поверхностью вовнутрь, чтобы на него не села пыль. Промокать фильтровальной бумагой не рекомендуется - на мазке останутся бумажные волокна, и он может быть поврежден механически.

Отпечатки кроветворных органов.

Для исследования кроветворных органов, позволяющих судить об уровне кроветворения, готовятся отпечатки селезенки, печени и головного отдела почек. Методика тканевых отпечатков имеет ряд преимуществ перед гистологическими парафиновыми срезами: во-первых, эти отпечатки отражают без искажения состояние тонкой структуры клеток гемопоэтической ткани; во-вторых, сжатие - в методе тканевых отпечатков отсутствует. Последнее позволяет сравнивать клетки сосудистого русла крови и клетки, присутствующие в кроветворных органах на всех стадиях эритропоэза. Для получения отпечатков пинцетом захватывают орган и на расстоянии 5-6 мм от концов пинцета отрезают его. Затем срезанной поверхностью проводят по предметному стеклу. Отпечатки целесообразно накладывать поперек стекла таким образом, чтобы следы от печени, почек и селезенки одной и той же рыбы были на одном препарате (следует иметь в виду, что перед всеми указанными манипуляциями из органа предварительно выпускается как можно больше крови, что достигается в процессе взятия крови на анализ гематологических показателей из хвостового сосуда). Маркировка, фиксация, окраска, просушка отпечатков проводится так же, как и при работе с мазками крови.

Отпечатки помещают на 10 минут в фиксирующую жидкость Максимова (100 см 3 жидкости Ценкера и 5-10 см 3 формалина); затем препараты 10-20 мин. промывают водопроводной водой и пропускают через спирты 70-100° (по 10 минут в каждом). Отпечатки вновь помещают на 2-3 мин. в 70°-ный спирт, после чего не менее 10 мин. выдерживают в дистиллированной воде. Окрашивают по методу Паппенгейма, без предварительного высушивания. ( Pappenheim , 1899)

Метод сохранения мазков и отпечатков .

На предметное стекло с фиксированным и окрашенным мазком (или отпечатками) наносят пипеткой большую каплю пленкообразующей смеси: к 0,5 мл клея БФ-6 прибавляют 3 мл абсолютного спирта, 3 мл бутилового спирта. Покачивая стекло, капле дают равномерно растечься по его поверхности. Избыток с края стекла удаляют фильтровальной бумагой и стекло с препаратом кладут на горизонтальную поверхность для просушивания. При комнатной температуре пленка высыхает за 15-20 минут. Ускорить сушку можно, поместив препарат в термостат при 60°С.

Надписи, сделанные на предметном стекле водным раствором туши, полностью сохраняются.

После микроскопирования иммерсионное масло удаляют сухой фланелевой тряпочкой.

Этот способ значительно проще и удобнее гистологического метода заключения готового препарата в канадский бальзам. Использование кедрового масла для этой цели нежелательно, так как высыхая, оно кристаллизуется и при длительном хранении ведет к порче препарата.

Подсчет элементов красной крови .

Преобладающей клеточной формой крови рыб являются эритроциты. Зрелые клетки красной крови эллипсоидной формы имеют диаметр 5х15 микрон.(4,5х7,0 - 12,0х18,0) В центре расположено несколько вытянутое ядро темно-фиолетового цвета. Цитоплазма этих клеток, благодаря наличию гемоглобина, оксифильная, розовато-желтого цвета. релые эритроциты здоровых рыб всегда одинаковы по величине.

Разнообразие размеров (анизоцитоз) является признаком патологии. В то же время пойкилоцитоз - отклонение от нормы в форме, если он не носит массового характера, не всегда свидетельствует о патологии: эритроциты в процессе движения вращаются вокруг короткой и длинной своих осей, сталкиваются, деформируясь, несколько изменяя форму.

При оценке эритропоэза определяется процентный состав незрелых эритроцитов. Цитоплазма их окрашена более базофильно, ядра значительно светлее, рыхлые, крупные. Чем клетка менее зрелая, тем базофильнее ее цитоплазма, тем светлее, крупнее и рыхлее ядро. Совсем молодые эритроциты округлы, ядра у них большие и круглые.

Методика подсчета незрелых эритроцитов сводится к просчету по всему мазку (в различных его участках) 500 эритроцитов, и среди них отмечается количество незрелых форм, которое выражается в процентах, где за 100% принимают общее количество просчитанных на мазке эритроцитов.

Подсчет элементов белой крови .

Лейкоцитарную формулу определяют, подсчитывая в окрашенных мазках крови рыб 200 лейкоцитов, и выражают в виде процентного соотношения отдельных видов лейкоцитов. Ввиду того, что более крупные формы клеток (моноциты, нейтрофилы, миелобласты) располагаются больше по периферии, вдоль наружных краев мазка, а более мелкие (лимфоциты, микромиелобласты) находятся ближе к центру, клетки подсчитывают всегда по одной и той же определенной системе: половину клеток считают на одном конце мазка по зигзагообразной линии, другую половину - на другом конце, по этому же принципу.

Лучше двигаться по самым тонким, наиболее прозрачным местам мазка, где хорошо просматривается структура клеток. Особенно важно придерживаться указанного правила подсчета при патологических изменениях крови, выявить которые при этом будет значительно легче.

Процентное соотношение клеток белой крови просчитывается с помощью 11 клавишного счетчика для лейкоформулы. Изучая белые клетки, учитывают сдвиги ядер нейтрофилов - индекс сдвига ядер .

Повышение процента незрелых нейтрофильных клеток в периферической крови называется сдвигом влево . Снижение количества палочкоядерных нейтрофилов и присутствие гиперсегментированных ядер определяется как сдвиг вправо. Индекс сдвига рассчитывается по формуле:

Для выяснения отклонения в гематологических параметрах применяется показатель индекса сдвига лейкоцитов ( ИСЛ ). ИСЛ расчитывается как отношение числа гранулоцитов к сегментоядерным

ИСЛ у здоровых осетров 0,25-0,40; у карпов 0,30.