ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ МОНИТОРИНГА ГАМЕТОГЕНЕЗА И РЕПРОДУКТИВНОГО КАЧЕСТВА АЗОВО-ЧЕРНОМОРСКОЙ ИХТИОФАУНЫ
Г.Г. Корниенко, Л.А. Бугаев
Антропогенные изменения водных систем отражаются на процессах созревания и воспроизводства гидробионтов, в том числе рыб. Отслеживание адаптивных процессов, протекающих в гонадах в ответ на текущие условия среды может давать ценную информацию не только о морфологических, биохимических и функциональных отклонениях (нарушениях) в организме рыб, но и для аппроксимации этих данных на популяционный уровень организации ихтиообъекта.
Для гистологического анализа образцы тканей гонад фиксируются в 10 %-ном растворе формалина или смеси Буэна.
Степень зрелости половых продуктов оценивают на основании макроскопических признаков и гистологического анализа (Сакун, Буцкая, 1963) . При микроскопировании образцов тканей определяют наличие/отсутствие явных отклонений в гистоструктуре половых желез. Для этого определяют диаметры ооцитов, строение их оболочек, структуру цитоплазмы (степень вакуолизации, диаметры желтковых гранул, параметры жировых включений) , положение ядра в ооците, количество и расположение ядрышек, состояние фолликулярного эпителия и других тканей яичников (Трусов, 1964) . Состояние семенников оценивают по присутствию в цистах семенников половых клеток разных фаз: сперматогонии, сперматиды, спермии (Турдаков, 1972) .
Методика проведения гистологических исследований подробно описана в методическом руководстве «Физиолого-биохимические и генетические исследования ихтиофауны Азово-Черноморского бассейна» (2005) . При определении стадии зрелости гонад рыб следует придерживаться шкалы, описывающей макро- и микроскопические особенности репродуктивных органов (Сакун, Буцкая, 1963)
Определение степени зрелости половых продуктов у самок рыб
I стадия. Внешний вид половых желез. Половые железы имеют вид тонких прозрачных тяжей, иногда желтоватого или розового цвета Половые клетки простым глазом неразличимы. У большинства рыб по внешнему виду половых желез пол определить трудно. В конце I стадии зрелости в половых железах самок многих рыб появляются яйценосные пластинки, представляющие собой поперечные пластинчатые выросты. Особенно хорошо они различимы у рыб с незамкнутыми яичниками (например, осетровые) , несколько хуже у рыб, имеющих яичники с боковой полостью (например, карповые) . У рыб, имеющих яичники с центральной полостью (например, окуневые) , яйценосные пластинки можно различить только на поперечных разрезах органа
Гистологическая характеристика состояния половых желез. Половые клетки представлены оогониями и молодыми ооцитами периода протоплазматического роста. Оогониями называются половые клетки, которые являются родоначальными для всех яйцевых клеток, развивающихся на яичнике Визуально эти клетки обнаружить нельзя, их можно рассмотреть только микроскопом на гистологических препаратах при большом увеличении.
II стадия. Внешний вид половых желез. Яичники по-прежнему остаются прозрачными и почти бесцветными. Однако у сельдей из рода Clupea и Caspialosa , в связи с обилием кровеносных сосудов, яичники имеют красноватый цвет, часто довольно темный. Вдоль яичника проходит крупный кровеносный сосуд, дающий боковые ответвления. При рассматривании яичника через лупу хорошо различимы отдельные икринки. Они прозрачны и почти бесцветны. Часто в этой стадии зрелости в яичниках имеется большое количество жировой ткани (например, у осетровых) , которая появляется уже в I стадии и постепенно исчезает в последующих стадиях зрелости.
Гистологическая характеристика состояния половых желез. Основную массу половых клеток в яичниках II стадии зрелости составляют ооциты периода протоплазматического роста. Появляются ооциты, окончившие протоплазматический рост, которые имеют уже настолько крупные размеры (больше 180 мкм) , что их можно различить невооруженным глазом или при рассматривании яичника через лупу. Наряду с ооцитами, прошедшими период протоплазматического роста, в яичниках II стадии зрелости присутствуют также оогонии и ооциты начальных фаз периода протоплазматического роста, которые представляют резервный фонд.
III стадия. Внешний вид половых желез. В течение III стадии зрелости наблюдаются наибольшие различия во внешнем виде яичников у разных видов рыб. Общим для всех костистых рыб является значительное увеличение размеров икринок и яичников. Икринки при этом становятся непрозрачными, мутными и приобретают окраску от светло-желтой с различными оттенками до ярко-оранжевой. Соответственно изменяется и цвет яичников. У осетровых благодаря накоплению под оболочкой мелких гранул буровато-черного пигмента икринки приобретают характерную для них темную окраску.
Гистологическая характеристика состояния половых желез. При переходе яичников из II в III стадию зрелости изменяется характер роста ооцитов, предназначенных для выметывания во время очередного нереста. Они растут теперь не только за счет увеличения объема протоплазмы, но и в результате накопления питательных веществ. Этот период в развитии ооцитов может быть назван, поэтому периодом трофоплазматического роста
Трофические вещества в ооцитах костистых рыб образуются в форме капель жира и зерен желтка. Жировые капли и жировые вещества, входящие в состав желточных зерен, имеют прижизненную окраску от светло-желтого до оранжевого цвета с различными оттенками. Благодаря этому в течение III стадии изменяется цвет икринок и яичника в целом. Кроме питательных веществ, во время трофоплазматического роста в ооцитах появляются вакуоли, содержащие особое вещество углеводной природы. У осетровых эти вещества откладываются в виде мелких гранул, вакуолей у них не образуется.
Параллельно с процессом накопления всех этих веществ протекает формирование оболочек ооцита. К концу трофоплазматического роста ооцит имеет радиально исчерченную оболочку, пронизанную тончайшими порами, по которым в него поступают питательные вещества. Над радиально исчерченной оболочкой часто формируется еще одна оболочка, которая служит для прикрепления яиц к субстрату. У одних рыб она студенистая, у других — ворсинчатая. У некоторых рыб могут образовываться длинные нити или иные приспособления для прикрепления яиц к субстрату. Ооцит окружен слоем клеток, выполняющих функцию проведения в него питательных веществ. Эти клетки образуют как бы мешочек или фолликул и называются фолликулярными. Снаружи фолликул одет соединительнотканной оболочкой.
IV стадия. Внешний вид половых желез. Яичники крупные, занимают большую часть полости тела. Цвет их у разных рыб различен (в большинстве случаев желтый различных оттенков или оранжевый, у осетровых цвет яичников серый или почти черный в зависимости от степени пигментации икринок) . Икринки достигают конечных размеров, характерных для каждого вида рыб. При переходе яичника из IV стадии в V у костистых рыб икринки приобретают прозрачность.
Гистологическая характеристика состояния половых желез. В яичниках присутствуют ооциты, закончившие трофоплазматический рост и предназначенные для вымета при очередном нересте, а также оогонии и ооциты периода протоплазматического роста, составляющие резервный фонд. При переходе яичников из IV в V стадию зрелости ооциты старшей группы вступают в период созревания — завершающий период развития яйцевых клеток. В этот период ядро ооцита смещается к микропиле. Костистые имеют одно микропиле, у осетровых их обычно несколько. Микропиле представляет собой канал, пронизывающей радиально-исчерченную и студенистую оболочки, через который при оплодотворении проникает сперматозоид.
В процессе смещения ядра ооцит приобретает полярное строение. На одном полюсе (анимальном) ооцита располагается ядро и основная масса протоплазмы, на другом (вегетативном) — желток. Затем происходит частичное или полное слияние желтка и жира. В результате этого ооциты снова становятся прозрачными.
V стадия. Внешние признаки V стадии. При поднятии рыбы за голову или легком нажиме на брюшко икра свободно вытекает из анального отверстия. Разрыв фолликулов и выход икринок в полость яичника или в полость тела у одних рыб протекает синхронно, у других носит растянутый характер (несколько часов или даже дней) .
Гистологическая характеристика состояния половых желез. В течение этой очень кратковременной стадии завершается подготовка ооцитов к оплодотворению и происходит их освобождение от фолликулярной оболочки. Зрелые ооциты в яичниках рыб всегда располагаются по краю яйценосных пластинок. Поэтому при переходе самки в текучее состояние, когда фолликулярная оболочка (фолликул) разрывается, ооцит выпадает в полость яичника, а у осетровых, имеющих незамкнутые яичники, в полость тела. Лопнувшие фолликулы останутся в яичнике. В составе тканей яичника присутствуют также половые клетки резервного фонда.
VI стадия. Внешний вид половых желез . Яичники небольшого размера, дряблые, часто багрово-красного цвета. Багрово-красный цвет яичников связан с небольшими кровоизлияниями, возникающими при разрыве фолликулов.
Гистологическая характеристика состояния половых желез. Отличительной чертой яичников VI стадии зрелости является присутствие лопнувших фолликулов. По составу половых клеток у одних рыб яичники напоминают II стадию зрелости, у других — начало III. Поэтому после рассасывания лопнувших фолликулов перед началом нового цикла оогенеза яичники соответственно переходят во II или сразу в III стадию зрелости. Следовательно, после достижения половой зрелости из годичного полового цикла самок костистых рыб может выпадать не только I, но и II стадия зрелости.
Определение степени зрелости половых продуктов у самцов рыб
В полевых условиях определить состояние зрелости мужских половых клеток, не различимых невооруженным глазом вследствие очень малых размеров, весьма затруднительно Изменение внешнего вида гонад, используемое обычно для установления так называемых стадий зрелости семенников, дает часто лишь приблизительное представление о тех процессах формирования и выведения сперматозоидов, которые в данный момент могут протекать в половых железах. Поэтому для точного определения зрелости половых продуктов у самцов рыб необходим микроскопический анализ семенников в лабораторных условиях.
I стадия. В этой стадии семенники анатомически еще не вполне развиты. Гонады представляют собой очень тонкие прозрачные тяжики. Пол часто неразличим. Кровеносные сосуды у большинства рыб развиты слабо, гонады бесцветные, желтоватые или сероватые. У некоторых, рыб (окуневые) кровеносные сосуды развиты сильнее и гонады имеют бледно-розовый цвет.
Из половых клеток в семенниках присутствуют только от дельные крупные сперматогонии. Большое количество крупных клеток и определяет прозрачность железы на этой стадии. Такое состояние семенников характерно только для не половозрелых рыб.
II стадия. Для второй стадии зрелости семенников характерно присутствие половых клеток в первой стадии сперматогенеза (сперматогоний) в состоянии размножения.
В результате размножения семенных клеток семенники увеличиваются в размерах. Они теряют прозрачность, становятся мутными. Гонады имеют вид округлых тяжей или тонких лент чаще сероватого или бледно-розового цвета. У некоторых видов, например у проходных сельдей, вследствие сильного развития кровеносных сосудов, семенники приобретают оттенки от розового до багрово-красного.
III стадия. Характеризуется интенсивным протеканием всех стадий сперматогенеза — роста, созревания и формирования. К концу стадии появляются группы зрелых сперматозоидов.
На этой стадии, как правило, сильно увеличивается объем семенника. Цвет его в начале стадии — розовато серый, в конце — желтовато-белый. Семенные канальцы сплошь заполнены цистами с семенными клетками, находящимися на разных стадиях сперматогенеза, просветы канальцев очень узкие, поэтому семенники на ощупь плотные, упругие. При разрезании гонад лезвием бритвы края разреза не оплывают, а остаются заостренными. Лезвие бритвы в начале стадии остается чистым, в конце ее, в связи с появлением первых групп зрелых сперматозоидов, на его поверхности могут оставаться беловатые выделения, но в незначительном количестве.
IV стадия зрелости семенников характеризуется окончанием сперматогенеза. В канальцах семенника содержатся только зрелые сперматозоиды, вышедшие из цист, и крупные одиночные сперматогонии, представляющие запасный фонд половых клеток для повторения сперматогенеза уже в следующем сезоне.
В связи с образованием больших количеств сперматозоидов, являющихся очень мелкими клетками, семенники приобретают молочно-белый цвет. При разрезании гонад на лезвии бритвы остается белая масса; на срезе выступает капля густой спермы, края среза оплывают, закругляются.
Как видно из описания строения семенников, после того как сперматозоиды высвобождаются из цист и лежат свободно в просветах канальцев, нет никаких препятствий для выхода сперматозоидов в общий выводной проток и дальше из генитального отверстия в воду. Поэтому если сильно надавить на брюшко рыбы, имеющей семенники в конце IV стадии зрелости, можно получить каплю густой спермы, имеющей консистенцию густой сметаны.
V стадия зрелости семенников характеризует нерестовое состояние самцов — текучесть половых продуктов — и легко определяется при внешнем осмотре рыбы. На этой стадии образуется семенная жидкость, которая сильно разжижает массы сперматозоидов и вызывает их вытекание. Если слегка на давить на брюшко рыбы или изогнуть ее, из полового отверстия потечет сперма (молоки) , имеющая консистенцию молока или жидкой сметаны.
Семенники имеют молочно-белый цвет, на ощупь мягкие. По мере вытекания половых продуктов, размер семенников постепенно уменьшается. У многих рыб (сельди и др.) на этой стадии хорошо видны выводные протоки, заполненные спермой.
VI стадия зрелости семенников характеризует посленерестовое состояние половых желез. Сперма из семенных канальцев вытекла, семенники уменьшаются в размерах, спадаются и приобретают вид тонких вялых тяжей. Кровеносные сосуды расширены, семенники становятся розоватыми или буроватыми. Если разрезать их или надавить на брюшко рыбы, может появиться небольшое количество желтоватой жидкости. После VI стадии зрелости в семенниках снова начинается размножение сперматогоний, новая волна сперматогенеза, и семенники переходят во вторую стадию зрелости.
Подробнее опишем результаты исследования гонад на примере осетровых, судака и пиленгаса. В процессе изучения гаметогенеза осетровых рыб нами охарактеризованы последовательные стадии нормального созревания половых клеток в гонадах самцов и самок.
Фото 1. Осетр. Самка ювенальной стадии. Видны только оогонии. Нормальное состояние гонады
Фото 2. Осетр. Гонады I - II стадии зрелости впервые созревающей самки в возрасте 5 лет. Видны ооциты протоплазматического роста, расположенные между многочисленными оогониями. Ув. 8×10 ×
Фото 3. Осетр. Гонады II стадии зрелости впервые созревающей самки в возрасте 12 лет. Видны ооциты протоплазматического роста, расположенные по краям яйценосной пластины. Видны группы оогоний. Ув. 8×10 ×
Фото 4. Осетр. Гонады II стадии зрелости впервые созревающей самки в возрасте 11 лет. Ооциты располагаются плотно в несколько рядов среди нескольких групп оогоний. Ув. 8×10 ×
Фото 5. Осетр. Гонады II стадии зрелости повторно созревающей самки в возрасте 18 лет. Ооциты располагаются рыхло на яйценосной пластине. Ув. 8×10 ×
Фото 6. Осетр. Яичник III стадии зрелости. Наряду с ооцитами трофоплазматического роста встречаются протоплазматические ооциты резервного фонда. Ув. 8×10 ×
Фото 7. Пиленгас. Ооцит трофоплазматического роста. IV стадия зрелости. Ув. 8×10 ×
Фото 8. Осетр. Ооцит трофоплазматического роста. IV стадия зрелости. Ядро ооцита расположено эксцентрично. Ув. 8×4 ×
Фото 9. Осетр. Ооцит трофоплазматического роста. IV стадия зрелости. Ядро ооцита расположено эксцентрично. Ув. 8×4 ×
Фото 10. Пиленгас. Яичники VI – II стадии (посленерестовое состояние). На препарате видны протоплазматические ооциты и лопнувшие фолликулы. Ув. 8×10 ×
Фото 11. Судак. Яичники VI – II стадии (посленерестовое состояние). На препарате видны протоплазматические ооциты, лопнувшие фолликулы и фрагмент соединительнотканного тяжа. Ув. 8×4 ×
Фото 12. Осетр. Семенник III стадии. Присутствуют все стадии сперматогенеза. Идет образование сперматозоидов. Ув. 8×20 ×
Фото 13. Пиленгас. Семенник III стадии. Ув. 8×20 ×
Фото 14. Осетр. Семенник IV стадии. В ампулах видны сперматозоиды. Ув. 8×10 ×
Фото 15. Судак. Семенник IV стадии. В ампулах видны сперматозоиды. Ув. 8×10 ×
Фото 16. Пиленгас. Семенник VI – II стадии. На препарате видны зрелые сперматозоиды и пустые семенные канальцы. Ув. 8×20 ×
Условные обозначения: Оог — оогоний; По — ооцит протоплазматического роста; То — ооцит трофоплазматического роста; Ядро — ядро ооцита; Жз — желточные зерна; Ф — фолликул; Ст — соединительная ткань; Сп — сперматозоиды; Ск — семенные канальцы.
Нарушение процесса созревания половых продуктов у рыб
При диагностике функционального состояния репродуктивной системы рыб важное значение играет выявление тех или иных отклонений от нормы. Нарушение в физиологии и биохимии репродуктивных органов ведет не только к изменениям в процессах созревания половых продуктов, годичного полового цикла, но и к трансформации нерестового поведения.
Для диагностики нарушений в репродуктивной системе рыб используется классификация, предложенная Н.В. Акимовой и Г.И. Рубан (1996) . Данная классификация нарушений была разработана для осетровых рыб, но, как нам кажется, применима и для других ихтиообъектов.
Нарушения на клеточном уровне
Самки
А. Период превителлогенеза:
• деформация части ооцитов;
• вакуолизация кариоплазмы ооцитов;
• нарушение структуры цитоплазмы — ее «фрагментация» и неравномерное окрашивание образующихся фрагментов на гистологических препаратах;
• прямое деление ооцитов — амитозы.
Б. Период вителлогенеза:
• деформация части ооцитов;
• нарушение морфологии оболочек ооцитов: а) локальные утончения студенистой оболочки; б) наличие в студенистой оболочке вакуолеподобных структур невыясненной природы; в) расслоение оболочек ооцитов (студенистой и желточных) и их неравномерное окрашивание, свидетельствующее о биохимических нарушениях;
• нарушение ядерной оболочки у ооцитов, еще не достигших зрелости;
• образование полостей, заполненных веществом невыясненной природы, под оболочками и среди гранул желтка ооцитов.
Самцы
• Снижение подвижности сперматозоидов и их оплодотворяющей способности.
Нарушения на уровне тканей
Самки
• Асинхронное развитие ооцитов в период трофоплазматического роста;
• частичная или массовая резорбция ооцитов периода цитоплазматического роста;
• частичная или массовая резорбция ооцитов периода трофоплазматического роста;
• наличие в ткани гонад большого количества остаточной икры после нереста самок;
• скопление форменных элементов крови в тканях гонад в периоды цито- и трофоплазматического роста ооцитов;
• появление половых клеток (гониев и ооцитов) в тканях печени.
Самцы
• Локальное разрушение стенок семенных канальцев и образование полостей между ними;
• значительные локальные скопления форменных элементов крови в генеративной части гонад;
• концентрация жировой ткани между семенным канальцами;
• асинхронность сперматогенеза у видов с единовременным типом нереста;
• замещение отдельных участков семенников тканью печени и наоборот.
Нарушения на уровне органов
Самки
• Различные формы гермафродитизма;
• несоответствие уровня развития половых желез возрасту, размерам и массе рыб (задержка развития генеративной части гонад) ;
• включение поперечнополосатой мышечной ткани в яичниках;
• опухоли, кисты и другие новообразования на поверхности гонад.
Самцы
• Наличие соединительнотканных разрастаний в генеративной части половых желез;
• возникновение опухолей, кист и других новообразований на поверхности семенников.
Ниже приводятся некоторые виды отклонений и патологий, зафиксированных в ходе многолетних наблюдений за осетровыми рыбами в Азовском бассейне.
Фото 17. Осетр. Ооцит IV стадии. Нарушение структуры оболочек ооцита: расширение меланинового слоя, отсутствие радиальной исчерченности в радиальной оболочке. Ув. 10×10 ×
Фото 18. Осетр. Резорбция желтка в ооците. Ув. 10×10 ×
Фото 19. Осетр. Резорбция желтка в ооците. Ув. 10×10 ×
Фото 20. Осетр. Скопление меланина после резорбции зрелых ооцитов. Ооциты протоплазматического роста. Окраска по Маллори. Ув. 20×10 ×
Фото 21. Осетр. Деформация ооцитов протоплазматического роста. II стадия зрелости гонад. Окраска по Маллори. Ув. 20×10 ×
Фото 22. Осетр. Дегенерирующие ооциты IV стадии. Лизис желтка, расширение меланинового слоя, нарушение структуры оболочек ооцитов, деформация трофоплазматического ооцита. Окраска по Маллори. Ув. 10×10 ×
Фото 23. Осетр. На развивающейся гонаде II стадии зрелости присутствуют единичные ооциты в стадии резорбции и деформированные ооциты. Окраска по Маллори. Ув. 7×10 ×
Фото 24. Осетр. Ранняя дегенерация ооцита IV стадии зрелости. Расширение меланиновой оболочки ооцита. Окраска по Маллори. Ув. 7×10 ×
Фото 25. Осетр. Резорбция сперматозоидов в единичных ампулах. Ув. 10×20 ×
Фото 26. Осетр. Массовая резорбция сперматозоидов в ампулах семенников. Ув. 10×40 ×
Фото 27. Осетр. Семенник II стадии зрелости после резорбции. Ампулы со сперматоцитами. Ув. 10×20 ×
Фото 28. Осетр. Задержка созревания яичников, асинхронность развития ооцитов. Ув. 10×10 ×
Фото 29. Осетр. Дегенерация ооцитов протоплазматического роста. Окраска по Маллори. Ув. 10×10 ×
Фото 30. Осетр. Гермафродитизм: самка II стадии зрелости, самец IV стадии зрелости. Окраска по Маллори. Ув. 7×10 ×
Условные обозначения: Со — студенистая оболочка; Радиальная оболочка; Меланиновый слой; Об — оболочка ооцита; Ж — желток; М — скопление меланина; По — ооцит протоплазматического роста; Рез — резорбирующие сперматозоиды; Сп — сперматозоиды.
Список литературы
- Корниенко Г.Г., Ложичесвская Т.В., Реков Ю.И. Половое созревание азовского осетра // Рыбное хоз-во, 1988, № 3. — С. 93–95.
- Корниенко Г.Г. Ранние дегенеративные изменения в овоцитах кубанской севрюги Acipenser stellatus Pallas // Вопр. ихтиол. 1975, Т. 15, вып. 3. – С. 561-564.
| 
