Понедельник, 13.07.2020, 06:02
 Физиология и биохимия гидробионтов
Главная Регистрация Вход
Приветствую Вас, Гость · RSS
Меню сайта
Категории каталога
Физиология [9]
Биохимия [9]
Литература [0]
Генетика [1]
Ихтиология [0]
 Каталог статей
Главная » Статьи » Методики » Биохимия

Определение белка по методу Лоури

Метод основан на образовании биуретового комплекса, который в присутствии фенола дает характерную окраску пропорционально количеству белка.

 

Чувствительность метода

 

0,2 М в 0,05 мл исследуемого раствора.

Оборудование

 

Спектрофотометр СФ-4 или фотоэлектроколориметр .

Посуда:

 

пипетки на 1,0; 2,0; 0,1 мл;

мерные цилиндры или колбы на 100, 500 и 1000 мл;

пробирки на 3-10 мл.

Реактивы

 

0,1 N раствор NaOH ;

2% раствор Na2CO3 в 1 л раствора NaOH (реактив А);

0,5% раствор CuSO4 5H2O в 1% растворе виннокислого натрия (реактив В);

Реактив С - перед анализом 49 мл реактива А смешивают с реактивом В;

Реактив Фолина ;

Реактив Е готовят из реактива Фолина , разводя его дистиллированной водой.

Калибровочная кривая

 

На торсионных весах взвешивают 10 мг белка (яичный альбумин), растворяют в 100 мл 0,1 N раствора NaOH , оставляют для полного растворения на ночь. При растворении альбумина щелочь приливают постепенно, не взбалтывая. В серию пробирок берется 0,1; 0,2; :до 1 мл исходного раствора, объем в каждой пробирке доводится до 1 мл дистиллированной водой, соответственно приливается 0,9; 0,8 и т.д. мл воды. Контроль - 1 мл воды. После колориметрирования по полученным цифрам строится калибровочная кривая. На оси абсцисс откладываются значения концентрации (10γ, 20γ, 30γ и т.д.), по оси ординат - значения экстинции .

Ход анализа

 

Взвешивают на торсионных весах 200 мг исследуемой ткани. Растирают ее до образования однородной массы ( гомогената ) с 3 мл дистиллированной воды в фарфоровой ступке. Отмеривают микропипеткой 0,03 мл и выливают в пробирку с 7,5 мл 0,1 N раствора NaOH , взбалтывают.

Из полученного раствора берут 1 мл, добавляют 4 мл реактива С, через 10 минут приливают 0,2 мл реактива Е. Инкубируют в темноте. Через 30 минут от начала приливания смотрят на ФЭК на красном светофильтре (λ =670 нм) в кювете толщиной 20 мм.

Контроль

 

1 мл дистиллированной воды, 4 мл реактива С, 0,2 мл реактива Е.

Расчет

 

Полученные экстинции смотрятся по калибровочной кривой.

При навеске 200 мг количество белка в γ умножается на К = 2,52, выражается в мг/г сырой ткани.

Категория: Биохимия | Добавил: bugayov (12.05.2008) | Автор: Леонид Бугаев
Просмотров: 9623 | Рейтинг: 1.0/1 |
Форма входа
Поиск
Друзья сайта
GISMETEO: Погода по г. Ростов-на-Дону

Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0