Реактивы |
|
Ацетатный буфер рН 2,8; 3,2.
0,5 N NaOH .
5 % ТХУ.
2,5 % раствор гемоглобина
Реактив Фолина |
Ход анализа |
|
Метод
определения активности катепсина Д основан на его способности
гидролизовать гемоглобин с образованием пептидов , растворимых в
присутствии трихлоруксусной кислоты.
Гомогенаты
готовят на дистиллированной воде при разной концентраций тканей: гонады
и мышцы -30%, печень и икра - 10%. Реакционная смесь состоит из 0,5 мл
0,35 М ацетатного буфера (рН 2,8 для сыворотки, рН 3,2 для других
тканей). 0,5 мл гомогената и 1 мл 2,5% гемоглобина. Инкубацию проводили
при 37 °С 60 мин. при встряхивании. Реакцию останавливали, добавляя 2
мл 5% ТХУ. К 1 мл супернатанта для нейтрализации добавляют 2 мл 0,5 N
NaOH и о,5 мл реактива Фолина . Активность фермента выражали в мкМ
тирозина (мг белка/час). Количество белка определяют методом Лоури. |
