Измерение
содержания цитохромов В5 и Р450 проводили в суспензии микросом (100-200
мкл трис - HCl буфер р H 7,4 и 1-2 мг белка в 1 мл) на спектрофотометре
(по двухлучевой схеме).
В
каждую из кювет вносили по 4 мл инкубационной смеси. Запись проводили в
диапазоне длин волн 450-500 нм. Контроль - несколько кристаллов
дитионита для записи дифференциального спектра цитохрома В5. При этом
максимум поглощения имеет место при 409 нм, а минимум - при 428 (ΔОП 408-428 ) служит показателем, характеризующим содержание цитохрома .
Содержание цитохрома В5 в микросомной фракции рассчитывается с помощью коэффициента молярной экстинкции 164 . 10 3 см -1
. М -1 (Omura, Sato, 1964).
Измерение
содержания цитохрома Р450 проводили по двухлучевой схеме. После записи
нулевой линии через кювету с пробой в течение 1 мин. пропускали СО,
полученную смешиванием концентрированных растворов муравьиной и серной
кислот и очищали пропусканием через раствор пирогаллола. Затем в обе
кюветы добавляли несколько кристаллов дитионита и записывали
дифференциальный спектр. Разница между максимумом поглощения при 450 нм
и минимумом при 475 или 490 нм является показателем содержания
гемопротеида в микросомах.
Содержание цитохрома Р450 рассчитывалось по коэффициенту молярной экстинкции 91 . 10 3 см
-1 . М -1 (Omuro , Sato, 1964). Оно составляет 0,8-0,9 нМоль/мин . в 1 мг.
Рабочая
методика. Суспензию микросом разводили с помощью трис-НС I буфера,
чтобы в одном мл суспензии содержалось ~2 мг белка. Для этого 0,8 мл
суспензии разводили 3,2 мл трис-НСI . Затем в кюветы добавляли по 2 мл
суспензии плюс несколько кристаллов дитионита . По спектру определяем
количество цитохрома В5. Затем контрольную пробу насыщаем угарным газом
~ 1 мин. После насыщения прибавляем дитионит . Записываем спектр
цитохрома Р450. | 
