Пятница, 10.07.2020, 22:10
 Физиология и биохимия гидробионтов
Главная Регистрация Вход
Приветствую Вас, Гость · RSS
Меню сайта
Категории каталога
Физиология [9]
Биохимия [9]
Литература [0]
Генетика [1]
Ихтиология [0]
 Каталог статей
Главная » Статьи » Методики » Биохимия

Определение содержания цитохромов В5 и Р450

Определение содержания цитохрома В5 основано на измерении разницы в поглощении окисленной и восстановленной форм гемопротеида , а цитохрома Р450 - на измерении величины поглощения комплекса, восстановленного цитохрома Р450 с окисью углерода при 450 нм.

Оборудование:

 

Спектрофотометр СФ - 46.

Центрифуга

Реактивы

 

Хлорид калия 1,15 % р - р.

Трис - HCl буфер 0,1 М р - р , рН 7,4.

0,04 Н CaCl2

Концентрированный раствор муравьиной и серной кислот.

Ход определения

 

Измерение содержания цитохромов В5 и Р450 проводили в суспензии микросом (100-200 мкл трис - HCl буфер р H 7,4 и 1-2 мг белка в 1 мл) на спектрофотометре (по двухлучевой схеме).

В каждую из кювет вносили по 4 мл инкубационной смеси. Запись проводили в диапазоне длин волн 450-500 нм. Контроль - несколько кристаллов дитионита для записи дифференциального спектра цитохрома В5. При этом максимум поглощения имеет место при 409 нм, а минимум - при 428 (ΔОП 408-428 ) служит показателем, характеризующим содержание цитохрома .

Содержание цитохрома В5 в микросомной фракции рассчитывается с помощью коэффициента молярной экстинкции 164 . 10 3 см -1 . М -1 (Omura, Sato, 1964).

Измерение содержания цитохрома Р450 проводили по двухлучевой схеме. После записи нулевой линии через кювету с пробой в течение 1 мин. пропускали СО, полученную смешиванием концентрированных растворов муравьиной и серной кислот и очищали пропусканием через раствор пирогаллола. Затем в обе кюветы добавляли несколько кристаллов дитионита и записывали дифференциальный спектр. Разница между максимумом поглощения при 450 нм и минимумом при 475 или 490 нм является показателем содержания гемопротеида в микросомах.

Содержание цитохрома Р450 рассчитывалось по коэффициенту молярной экстинкции 91 . 10 3 см -1 . М -1 (Omuro , Sato, 1964). Оно составляет 0,8-0,9 нМоль/мин . в 1 мг.

Рабочая методика. Суспензию микросом разводили с помощью трис-НС I буфера, чтобы в одном мл суспензии содержалось ~2 мг белка. Для этого 0,8 мл суспензии разводили 3,2 мл трис-НСI . Затем в кюветы добавляли по 2 мл суспензии плюс несколько кристаллов дитионита . По спектру определяем количество цитохрома В5. Затем контрольную пробу насыщаем угарным газом ~ 1 мин. После насыщения прибавляем дитионит . Записываем спектр цитохрома Р450.

Категория: Биохимия | Добавил: bugayov (12.05.2008)
Просмотров: 1875 | Рейтинг: 0.0/0 |
Форма входа
Поиск
Друзья сайта
GISMETEO: Погода по г. Ростов-на-Дону

Статистика

Онлайн всего: 1
Гостей: 1
Пользователей: 0