Вестник Дагестанского научного центра РАН, 2001, № 9.

 УДК 574.5/64:504.064

 КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ НЕФТЯНОЙ

ИНТОКСИКАЦИИ СЕГОЛЕТОК РУССКОГО ОСЕТРА

 А.М.Бутаев, А.Р.Исуев, У.Г.Магомедбеков, С.К.Монахов

Для оценки и прогноза изменений состояния природных экосистем широко используются непрерывные или регулярные измерения их физических, химических и биологических параметров, лежащие в основе экологического мониторинга. Между тем экосистемы достаточно долго сохраняют "следы" прошлого, с помощью которого можно не только реконструировать пройденный ими путь развития, но вкупе с оценкой текущего состояния также составить прогноз того, что их ожидает в будущем. Такие исследования мы называем экологической диагностикой, поскольку в отличие от экологического мониторинга они могут носить единовременный характер. Наибольших успехов экологическая диагностика достигла в области биохимии и физиологии – последствия перенесенных организмами стрессов порой ощущаются в течение всей их жизни. По нашему мнению, широкие возможности для развития экологической диагностики открывает также биотестирование, если оно сочетается с изучением кинетических закономерностей воздействия внешних факторов на биологические системы.

При биотестировании природных вод обычно встают два вопроса [1]: токсична ли данная природная вода, а если токсична, то какова степень ее токсичности.

Наличие токсичности устанавливают с помощью набора тест-организмов, включающего, как правило, представителей основных трофических уровней экосистемы - водоросли, зоопланктон, рыбы. Главное требование при их выборе - это высокая чувствительность к токсичному веществу.

Значительные сложности возникают при оценке степени токсичности природных вод. Существующие методы ее оценки можно условно разделить на три группы.

Первая группа предусматривает разработку предельно допустимой концентрации (ПДК) токсичного вещества [2] путем определения таких параметров тест-объектов, как летальная или эффективная концентрация для 50% организмов (ЛК₅₀ или ЭК₅₀), острое и хроническое действие токсичного вещества (ОТД или ХТД) на "выживаемость", "плодовитость", "изменение роста" и т.д., ориентировочно безопасного уровня содержания токсичного вещества (ОБУВ) или его максимальной недействующей концентрации (МНК) и других аналогичных параметров.

При всей привлекательности нормирования природных вод с помощью ПДК или подобных ему показателей, оно, строго говоря, антиэкологично. Во-первых, такое нормирование признает существование нижнего безопасного порога концентрации токсиканта в объектах биосферы, что во многих случаях, например, при оценке воздействия канцерогенов, далеко не бесспорно, и, во-вторых, в природных водах присутствуют сотни и тысячи химических веществ, которые проявляют друг к другу ингибирующее, аддитивное и синергическое действие, а многие безвредные вещества в определенных условиях становятся токсичными. Принцип ПДК, равно как ОБУВ или МНК, может быть использован для лимитирования сброса токсичного вещества в водоем, но не для отображения экологического состояния самого водоема.

Второй способ основан на разработке шкал токсичности [3], например, с помощью формулы Хабера

                                       E = C·t,                                                               (1)

где E - эффект; C - концентрация токсичного вещества; t - время действия.

Критерий Хабера лишен характерных для ПДК недостатков, однако он позволяет выразить степень токсичности только качественно, как гипер-, остро-, умеренно-, слаботоксичная и не токсичная.

К третьей группе можно отнести количественные способы выражения степени токсичности природных вод. Наибольшее распространение среди них получил способ оценки токсичности в баллах с помощью так называемой формулы "суммарной токсичности" [1]:

t_Х = 1_T(i)/(t_T(i)·n),                                               (2)

где t_Х - "суммарная токсичность"; 1_T(i) - условный балл класса реакций тест-организмов; t_T(i)- время проявления реакции тест-организма;  n - число тест-организмов, у которых отмечена соответствующая реакция.

Согласно (2), чем больше значение t_Х, тем выше балл токсичности, и по этому критерию уровень токсичности природной воды изменяется от нетоксичной (балл токсичности = 0) до чрезвычайно токсичной (балл токсичности = 500). Следовательно, критерий t_Х, также как и ПДК, "признает" существование нижнего порога действия токсичного вещества. Бальную систему используют также при ранжировании токсичности по кратности разбавления (при нормировании сброса сточных вод) и при оценке экологического статуса водоема в терминах "олиго-политоксичность" (при классификации вод по сапробности) [4].

Особо следует сказать о прогностических возможностях существующих критериев оценки токсичности природных вод. Критерии (1) и (2), фиксируя физиолого-морфологические реакции тест-организма, с той или иной степени достоверности отражают состояние природных вод в данный момент времени, но они не могут быть использованы для ранней диагностики токсического воздействия того или иного вещества. Между тем, в условиях все возрастающего антропогенного воздействия на окружающую среду, вопросы раннего прогнозирования устойчивости природных экосистем становятся приоритетными. Иными словами, речь идет об оценке изменений, происходящих в экосистеме до проявления морфологических, физиологических, популяционных и других отклонений от нормы и их использования для предсказания возможных путей развития экосистемы.

Это обстоятельство вынуждает перенести акцент мониторинговых исследований природных вод на изучение биохимических процессов, происходящих в тест-организмах при воздействии токсичного вещества. Надо заметить, что проблемам биохимии водных организмов в последнее время уделяется огромное внимание, однако при попытке использовать их в прогностических целях возникают существенные, предопределенные сложностью и многообразием биохимических процессов, трудности.

Нами предлагается иной подход к оценке токсичности природных вод. Он основан на: а) абстрагировании от механизма биохимического воздействия загрязняющего вещества на тест-организм и б) использовании для описания реакции тест-организма на загрязняющее вещество представлений формальной химической кинетики, основанных на принципе лимитирующей (или скорость определяющей) стадии сложных процессов. Действительно, любой отклик тест-объекта на токсичное вещество можно представить, как результатом химической реакции между "активными центрами" тест-организма и токсичным веществом. Тогда формально кинетика отклика тест-организма на токсичное вещество можно записать в виде:

±dZ/dt = k·C₁·C₂ = k·a·C₁·C₃,                                           (4)

где Z - положительный (+) или отрицательный (-) отклик тест-организма; t - время; C₁ - концентрация активных центров тест-организма; C₂ - концентрация токсиканта в фазе тест-организма; C₃ - концентрация токсиканта в водной фазе; a - коэффициент пропорциональности между С₂ и С₃; k - константа скорости реакции отклика тест-организма. Ясно, что в качестве количественного критерия степени токсичности природных вод здесь выступает параметр k.

Распространение представлений формальной химической кинетики [5] на биотестирование, проведя при этом некоторую аналогию между сорбционными свойствами полимерных и биологических мембран [6], позволяет предвидеть два крайних случая: С₁=k₁C₂ и C₂>>C₁. Тогда уравнение (4) можно переписать в виде 

±dZ/dt = k₁·C₂²,                                                       (5)

или в виде

±dZ/dt = k₂·C₁,                                                        (6)

где k₁ = k·С₁; k₂ = k·C₂ = k·a·C₃.

Из последних выражений следует, что в зависимости от соотношения концентраций активных центров тест-организма и токсичного вещества, реакция отклика тест-организма может быть как бимолекулярной, так и мономолекулярной.

С целью апробирования предлагаемого подхода для мониторинговых исследований изучалось воздействие нефтяного загрязнения на сеголетки русского осетра. В качестве тест-реакции на нефтяные углеводороды (НУ) было использовано изменение концентрации суммарных сульфгидрильных групп в тканях сеголеток. Для этого по 12 экземпляров сеголетки русского осетра длиной тела 6-8 см помещали в аквариумы объемом 20 л с различным содержанием сырой нефти. Предварительно нефть эмульгировали перемешиванием механической мешалкой в течение 10 минут при комнатной температуре. Смена раствора проводили через каждые 3 суток. По истечении заданного времени рыбы извлекали из аквариума и подвергались биохимическому анализу. Параллельные измерения проводили на контрольных рыбах, содержащих в аквариуме без нефти. В процессе опыта рыбы кормили живым трубочником.

Сульфгидрильные группы в тканях сеголеток, солюбилизированных додецилсульфатом натрия, определяли методом амперометрического титрования, в качестве титранта использовали нитрат серебра [7].

Выбор в качестве тест-реакции изменение содержания SH-групп в тканях сеголеток обусловлен следующим. Сульфгидрильные группы выделяются среди других функциональных групп рыб высокой реакционной способностью и многообразием химических реакций, в которые они вступают - алкилирование, ацилирование, окисление, тиолдисульфидный обмен, образование меркаптидов, полумеркаптилий, меркапталов, водородных связей и комплексов с переносом заряда [8]. Во многих реакциях SH-группы принимают участие в форме меркаптидного иона, обладающего высокой нуклеоофильной способностью, они легко окисляются молекулярным кислородом, его радикалами, перекисью водорода [9]. Среди процессов, протекающих в организме с участием SH-групп белковой и небелковой природы, следует отметить ферментативные реакции - в настоящее время насчитывается около 100 ферментов, в активности которых принимают участие SH-группы [9]. SH-групп играют важную роль в ряде физиологических и биохимических процессов - в нервной деятельности, мышечном сокращении, делении клеток, регуляции проницаемости мембран митохондрий, окислительном декарбоксилировании a-кетакислот, окислительном фосфолировании, фотосинтезе, механизме радиационных поражений и при действии токсичных веществ. Из сказанного следует, что концентрация SH-групп должна тонко реагировать на присутствие в природной воде токсичного вещества.

Полученные экспериментальные данные приведены на рис. 1. Они показывают, что выдерживание рыб в воде, содержащей нефть, приводит к уменьшению концентрации SH-групп белков и низкомолекулярных тиоловых соединений сеголеток русского осетра. Для краткости назовем этот процесс дезактивацией SH-групп, и применительно к нему перепишем уравнения (5) и (6) в виде:

-dC_SH/dt = k₁C²_SH,                                                    (7)

-dC_SH/dt = k₂C_SH.                                                     (8)

Решение последних двух уравнений при начальных условиях, t = 0, C_SH = C⁰_SH, дает соответственно (9) и (10):

C_SH = C⁰_SH/(1+k₁tC⁰_SH),                                          (9)

C_SH = C⁰_SH[1-exp(-k₂t)],                                        (10)

где C⁰_SH и C_SH - концентрация сульфгидрильных групп в теле сеголеток до и после воздействия НУ в течение времени t.

Построение анаморфоз уравнений (9) и (10) показала (рис. 2), что кинетика процесса дезактивации сульфгидрильных групп сеголеток лучше подчиняется уравнению реакции второго порядка, чем уравнению реакции первого порядка. Найденные по тангенсу угла наклона прямых 1/C_SH=f(t) значения величин k₁ приведены в табл. 1.

Таблица 1. Константы скорости дезактивации SH-групп сеголеток русского осетра при их экспозиции в воде, содержащей нефть

Полученные нами данные не позволяют однозначно подтвердить или однозначно опровергнуть вопрос о пороге токсического воздействия нефти на гидробионты. В пределах точности эксперимента зависимость константы скорости дезактивации SH-групп от концентрации нефти в воде (С_ну) может носить либо линейный

 k₁=20,23·C_ну,                                                            (11)

либо нелинейный

k₁=1,30+9,28·C_ну+11,04·С²_ну                                   (12)

характер (рис. 3). Очевидно, при оценке токсического воздействия нефтяных углеводородов на гидробионты необходимо исходить не из общего их содержания в воде, а из концентрации растворенных (активных) форм. Однако на практике не будет большой ошибкой, если исходить из предположения о беспороговом влиянии нефтяного загрязнения и принять, что

                                k₁ = b·C_ну,                                                        (13)

где b - коэффициент пропорциональности; С_ну - содержание нефтяных углеводородов в воде, мг/л.

Если это предположение верно, то, объединив уравнения (9) и (13), получим выражение

             C_SH = C⁰_SH/(1+b·C_ну·C⁰_SH·t),                                            (14)

которое позволяет прогнозировать воздействие нефтяных углеводородов на концентрацию SH-групп в тканях сеголеток при любых значениях нефтяного загрязнения и при любых длительностях экспозиции. О точности выполнимости уравнения (14) можно судить по данным рис. 1, где сопоставлены экспериментальные значения SH-групп в тканях сеголеток с теоретически рассчитанными кривыми.

В заключение отметим, что уравнение (12) позволяет решить и обратную задачу. Например, зная концентрацию SH-групп в тканях рыб, обитающих в загрязненной нефтью природной воде, можно найти время их пребывания в такой воде, а зная концентрацию SH-групп в тканях рыб и их возраст можно оценить "интегральное биологическое воздействие" нефтяного загрязнения природных вод на гидробионты.

ЛИТЕРАТУРА

1. Никоноров А.М., Хоружая Т.А., Бражникова Л.В., Жулидов А.В. Мониторинг качества вод: оценка токсичности. С.-Петербург. Гидрометеоиздат. 2000. 150 с.

2. Санитарные правила и нормы охраны поверхностных вод от загрязнения. М.: Минздрав СССР. 1988. 69 с.

3. Строганов Н.С. Теоретические аспекты действия пестицидов на водные организмы // Экспериментальная водная токсикология. 1973. Т.5. С. 11-37.

4. Экологический энциклопедический словарь. М.: Ноосфера. 1999. 930 с.

 5. Панченков Г.М., Лебедев В.П. Химическая кинетика и катализ. М.: Химия. 1974. 591 с.

6. Бутаев А.М., Тулупов П.Е. Необменная сорбция минеральных кислот стиролдивинилбензольными сульфокатионитами // Журнал физ. хим. 1973. Т. 47, № 7. С. 1817-1819.

7. Соколовский В.В. Амперометрический метод определения низкомолекулярных и белковых сульфгидрильных групп // Вопросы мед. химии. 1977. № 3. С. 15-20.

8. Меерсон Ч.З. Адаптация, стресс, профилактика. М.: Наука. 1981. 278 с.